細胞凋亡檢測

一、細胞凋亡檢測介紹

人體內的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關細胞死亡過程的研究，已成為生物學、醫學研究的一個熱點。已知的細胞死亡方式起碼有兩種，即細胞壞死與細胞凋亡(apoptosis)。細胞壞死是早已被認識到的一種細胞死亡方式，而細胞凋亡則是逐漸被認識的一種細胞死亡方式。

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細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要的作用。細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型，而且具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發細胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。

二、檢測方法

細胞發生凋亡時，不同區域內（如細胞膜、細胞漿、線粒體、細胞核等）會發生不同的生理生化改變。因此，針對不同區域的細胞凋亡檢測要采用不同的方法。

1）Annexin V 凋亡檢測

原理：Annexin Ⅴ是一種分子量為35-36kD的Ca依賴性磷脂結合蛋白，正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，與PS有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。該方法通常結合流式細胞術一起使用。

2）線粒體膜電位分析（JC-1）

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。

原理：在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產生紅色熒光（Ex/Em = 585/590）；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體（monomer），可以產生綠色熒光（Ex/Em = 510/527 nm）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。

3）Caspase活性檢測

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導的信號轉導途徑。

原理：激活后的下游 Caspase，通過切割特異性底物，導致細胞凋亡。Caspase的活化是導致細胞凋亡的中心環節，細胞凋亡功能的抑制將導致腫瘤的發生及免疫功能的異常，而細胞凋亡功能亢進與組織損傷和器官功能衰竭的發病密切相關。

4）TUNEL凋亡檢測

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和熒光素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，稱為TUNEL法。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL是檢測DNA 片段化（細胞凋亡）的常用方法。

細胞凋亡是生命的基本現象，是維持體內細胞數量動態平衡的基本措施。在胚胎發育階段通過細胞凋亡清除多余的和已完成使命的細胞，保證了胚胎的正常發育；在成年階段通過細胞凋亡清除衰老和病變的細胞，保證了機體的健康。和細胞增殖一樣細胞凋亡也是受基因調控的精確過程。

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